全国疟疾日 | 单细胞测序技术揭示疟疾患者免疫细胞亚群的动态变化

　　2024年4月26日是我国第17个“全国疟疾日”。在全球范围内，疟疾是一个重大的公共卫生问题，据报道2021年疟原虫感染引起疟疾超过2.4亿例，导致死亡超过60万例，其中致病程度最严重且死亡率最高的是恶性疟原虫（P.falciparum）感染，是流行地区危害儿童健康的高风险因素。

　　已有研究发现，受感染后疟疾病人体内免疫反应复杂，涉及多种免疫细胞的激活，揭示这些免疫细胞变化的细节，可以更好理解相关机制，为开发更有效的疫苗策略提供相关支持。

　　01研究目标

　　本研究聚焦于疟原虫诱导免疫细胞所发生的变化，针对P.falciparum感染所发生的免疫调节反应，通过单细胞测序技术来检查分析免疫细胞亚群，识别出参与特异性反应的细胞类型，在细胞水平上揭示疟原虫感染所诱导的耐受性反应，从而有助于开发相关药物或疫苗以增强保护性免疫力。

　　02研究方法

　　1.队列设计：6名疟疾患者，分别采集第0天、7天和28天血液；2名健康对照。

　　2.单细胞RNA测序（scRNA-seq）：针对外周血单核细胞（PBMCs）进行分离测序。

　　3.数据分析：包含细胞聚类、差异基因挖掘、富集分析等。

　　4.流式细胞检测验证：对重要的关键因子变化在蛋白质水平上进行验证。

　　03研究结果

　　1.免疫细胞亚群发生变化，比如CD4 T细胞和增殖细胞增加，而NK细胞、γδT细胞和B细胞的比例减少。

　　2.单核细胞和树突状细胞呈现免疫抑制特征，比如炎症细胞因子基因和MHC类II HLA-DR基因下调。

　　3.NK细胞的亚群激活变化，识别出NK细胞的5个亚群。

　　4.γδT细胞的激活调节，其细胞亚群中CytotoxicγδT细胞比例增加。

　　5.CD4 T细胞以Tr1细胞亚群为主导，并且Tr1细胞上调IL10和IFN-γ的表达。

　　6.识别出7个细胞亚群，发现调节性B细胞（Bregs）扩张，并且HIF1A上调。

　　04研究结论

　　通过单细胞测序探讨了疟疾患者感染寄生虫期间，先天和适应性免疫细胞的变化机制，研究分析了疟疾期间免疫细胞特异性和适应性的免疫变化和调节，为进一步研究奠定基础。

　　05研究结果展开

　　图1.显示疟疾感染期间免疫细胞不同亚群及转录变化

　　a.展示样本收集和单细胞转录组学分析的工作流程。收集并分选3个时间点的外周血单核细胞（PBMCs），进行10X Chromium单细胞测序，鉴定细胞类型和亚群，筛选分析差异基因，对关键因子从蛋白水平进一步确认。

　　b.点图显示用于注释细胞类型的标记基因平均表达。

　　c.UMAP分析展示所鉴定出的细胞亚型。

　　d.展示单细胞测序所鉴定细胞与细胞流式检测结果的相关性。

　　e.展示不同细胞亚群在三个时间点的动态变化，包括CD14单核细胞、CD4 T细胞、B细胞等。

　　f.展示不同时间点相比较所呈现的差异基因数量情况。

　　图2.疟疾感染第0天和28天对比，CD14、CD16单核细胞、cDCs、pDCs树突细胞间的差异基因分析

　　a.Upset图概括展示2个时间点对比中4种不同细胞共有的及独有的差异基因（DEGs）量。

　　b.展示2个时间点单核细胞和树突细胞对比分析出来的差异基因（DEGs）。

　　c.展示2个时间点单核细胞和树突细胞间基因集富集分析（GSEA）结果。

　　d.展示2个时间点单核细胞和树突细胞间DEGs的上游调控因子分析。

　　e.展示2个时间点单核细胞和树突细胞间TNF、IL1β、IL6及MCP1细胞因子的对比。

　　f.展示2个时间点表达TNF、IL1β、IL6及MCP1细胞因子的细胞亚群对比。

　　g.展示2个时间点联合表达TNF、IL1β、IL6及MCP1细胞因子的细胞亚群对比。

　　图3.展示疟疾感染期间NK细胞亚群的变化

　　a.UMAP分析展示5个细胞亚群：CD56 bright、Transitional、IFNγ+Adaptive、IFNγ-Adaptive和PD1+。

　　b.展示标记基因与5个细胞亚群。

　　c.展示5个细胞亚群在3个时间点的变化。

　　d.Upset图概括展示2个时间点对比中5个细胞亚群共有的和独有的DEGs量。

　　e.展示2个时间点对比5个细胞亚群中排名前20的DEGs。

　　f.展示对比分析3个NK亚群CD56 bright、Adaptive和PD1+细胞流式检测6因子结果。

　　g.SPICE分析展示对比分析3个NK亚群细胞流式检测共表达相关因子的结果。

　　h.连接直方图展示两个时间点下3个NK亚群细胞流式检测6因子的结果。

　　图4.展示疟疾感染期间γδT细胞亚群的变化

　　a.UMAP分析展示6个细胞亚群：细胞毒、炎性、抗原呈递、过渡、Type 3型和初始型。

　　b.展示标记基因与6个细胞亚群。

　　c.Upset图概括展示2个时间点对比中6个细胞亚群共有的和独有的DEGs量。

　　d.展示2个时间点对比6个细胞亚群中排名前20的DEGs。

　　e.展示2个时间点对比Vδ2和Vδ1类型γδT细胞的流式细胞仪分析结果。

　　f.展示2个时间点对比Vδ2和Vδ1类型γδT细胞表达8因子的结果。

　　g.SPICE分析展示2个时间点Vδ2和Vδ1类型γδT细胞共表达6因子的结果。

　　图5.展示疟疾感染期间CD4 T细胞亚群的变化

　　a.UMAP分析展示9个细胞亚群.

　　b.展示标记基因与9个细胞亚群。

　　c.Upset图概括展示2个时间点对比中9个细胞亚群共有的和独有的DEGs量。

　　d.展示2个时间点对比5个细胞亚群中排名前20的DEGs。

　　e.展示2个时间点对比分析8个亚群细胞流式检测6因子结果。

　　f.连接直方图展示3个亚群细胞流式检测4因子的结果。

　　g.SPICE分析展示对比分析2个时间点7个亚群细胞流式检测共表达6因子的结果。

　　图6.展示疟疾感染期间B细胞亚群的变化

　　a.UMAP分析展示7个细胞亚群.

　　b.展示标记基因与7个细胞亚群。

　　c.Upset图概括展示2个时间点对比中7个细胞亚群共有的和独有的DEGs量。

　　d.展示2个时间点对比7个细胞亚群中排名前20的DEGs。

　　e.展示2个时间点对比分析7个亚群细胞流式检测结果。

　　f.展示第0天样本中不同亚群细胞流式检测CD98的结果。

　　g.展示对比分析2个时间点7个亚群细胞表达HF1A的结果。

　　h.展示对比分析2个时间点B细胞表达IL-10的结果。

　　i.SPICE分析展示第0天样本中共表达IL-10、IL6与TNF的结果。

　　j.展示第0天样本中表达IL-10的淋巴细胞亚群比例。

　　06总结与启发

　　该篇文献发表于Nature Communications（IF>17），这项研究通过单细胞测序的方法，分析疟疾患者体内免疫细胞亚群的调节变化。

　　临床样本选择了3个时间点，以观察疾病进程中免疫的动态变化，并纳入健康对照，样本检测主要采用单细胞测序与流式细胞仪分析。实验数据进行了多维度分析，涵盖转录数据整体分析与相关标志物验证，以提供细胞类别与功能状态的全面信息，通过比较时间点之间的DEGs以识别与疟疾感染的基因表达变化，并重点关注与免疫调节相关的因子表达变化。

　　通过这篇文献，可以学习到免疫学相关单细胞测序课题开展设计各环节，通过细致的数据分析来揭示免疫细胞亚群的复杂动态变化。

　　参考文献

　　Dooley NL,Chabikwa TG,Pava Z,et al.Single cell transcriptomics shows that malaria promotes unique regulatory responses across multiple immune cell subsets.Nat Commun.2023;14:7387.https://doi.org/10.1038/s41467-023-43181-7